Genome-wide discovery of structural variants and their potential role in DMI-propiconazole resistance in Monilinia species

Abstract

Yapısal varyantlar (SV'ler), boyutları 50 baz çiftinden büyük olan ve genomik DNA'nın boyutunu, kopya numarasını, konumunu, yönünü ve dizi içeriğini değiştirebilen varyantlardır. SV'lerin çeşitli tipleri arasında insersiyonlar, delesyonlar ve duplikasyonlar (kopya numarası varyasyonu (CNV) olarak da adlandırılır), translokasyonlar, inversiyonlar ve mobil element yer değiştirmeleri bulunmaktadır. Bu varyantların hayat ağacı boyunca doğal popülasyonlarda meydana gelebildikleri ve fenotipik farklılıklarla ilişkili olabildikleri kanıtlanmıştır. Bu nedenle, bu varyantların kapsamını belirlemek, doğal varyasyonun ve potansiyel adaptif evrimsel süreçlerin genetik temelini anlamak için önem arz etmektedir. Fungal bitki patojenlerinde fungisit direncinin ortaya çıkması patojenlerle mücadeleye zorlaştırrarak veya zayıflatarak tarımsal ürünlerde ciddi kalite ve verim kayıplarına neden olabilmektedir. Bu direncin ve/veya dirence katkı sunan genetik mekanizmaların anlaşılması hastalık yönetimi stratejilerinin geliştirilmesinde çok önemli bir adım sunmaktadır. Yapısal varyantların da fungisit direnç cevaplarını oluşturma yönünde etkileri olabileceği beklenmektedir. Bu tez çalışması kapsamında, Monilinia cinsi içerisinde yer alan ve özellikle sert çekirdekli meyvelerden şeftali konukçusunda kahverengi çürüklük hastalığının en öne çıkan etmenleri olan M. fructicola ve M. laxa patojenleri için hem tür içi hem türlerarası genom kıyalsmaları SV'ler açısından değerlendirilmiştir ve bu değerlendirmelerin DMI grubu fungisitlerden porpikanazol etken maddesine verilen cevaplarla ilişkisi sorgulanmıştır. Çalışma kapsamında Türkiye'den 108 M. fructicola ve 20 M. laxa izolatından oluşan Monilinia popülasyonunun Demetilasyon İnhibitör (DMI) grubu fungisiti propikonazol'e karşı duyarlılık durumu belirlenmiş, popülasyonun DMI-propikonazol'e karşı duyarlı olduğunu ortaya koyulmuştur. Fungisit fenotipleri dikkate alınarak seçilen toplam 16 izolatın tüm genom dizileri incelenmiştir. Sekiz M. fructicola ve sekiz M. laxa izolatı için karakterize edilen SV'lerin (INDEL'ler, CNV'ler, inversiyonlar ve mobil elementler (TEs)) DMI-propikonazol direncindeki potansiyel rolü, daha önce DMI direncinde rol aldığı kanıtlanmış aday genlerdeki veya yakınındaki SV durumu ile araştırılmıştır. Bu türler için tür içi ve türlerarası genom kıyaslamaları ile geniş kapsamlı olarak genom çapında SV'ler ve tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler) ilk kez belirlenmiştir. Sonuç olarak, M. fructicola genomlarının, referans temelli varyant çağırmasına dayalı olarak M. laxa türüne kıyasla daha fazla varyant içerdiği bulunmuştur (sırasıyla toplam 266.618 ve 190.599 SNP; 1540 ve 918 SV). Genomik datasetlerinde karakterize edilen toplam duplikasyon sayısı, M. fructicola için yedi duplikasyon ve M. laxa için üç duplikasyon ile her iki tür için de düşük sayıda bulunmuştur. SNP'lerin ve SV'lerin kapsamı ve dağılımı, türler arasında korunmuş ve türler arasında yüksek derecede değişken bulunmuştur. Ayrıca, her izolat için CNV'nin ayrıntılı karakterizasyonu, M. fructicola genomlarının yaklaşık %0,67'sinin ve M. laxa genomlarının yaklaşık %2,06'sının CN değişkeni olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, 15'ten fazla sınıflandırılmış familyaya sahip her iki tür için de mobil element içeriği yaklaşık %9 olarak bulunmuştur. Sınıf I/Retrotranspozonlar (özellikle LTR elementleri), beklendiği gibi her iki tür için de en baskın TE'ler olarak bulunmuştur. Her iki türün referans genomlarındaki TE'lerin Kimura-2 mesafeleri, yakın zamanlı insersiyonların her iki tür için de düşük olduğunu ve mevcut TE içeriğinin çoğunun daha eski insersiyon/çoğalmalardan kaynaklandığını göstermiştir. Sonuç olarak, SV'lerin DMI-propikonazol direncindeki potansiyel rolünün araştırılması, her iki tür için farklı duyarlılık seviyelerine sahip izolatlar için insersiyon, delesyon, duplikasyon ve inversiyon tiplerinden hiçbir SV'nin aday CYP51 ve ABC taşıyıcı genlerinde veya yakınında farklılık göstermediğini ortaya koyuştur. Ancak, M. fructicola izolatlarında CYP51 geninin yukarı bölgesinde Sınıf II/Sat-2-LVa ve Sınıf I/DNA-8-3_HM'den oluşan iç-içe geçmiş bir TE'nin varlığı/yokluğu, DMI'ye karşı direnç için potansiyel bir risk sunmuştur.

Structural variants (SVs) are variants with sizes bigger than 50 base pairs and capable of changing the size, copy number, location, orientation, and sequence content of genomic DNA. The diverse forms of SVs include insertions, deletions, and duplications (also referred to as copy number variation(CNV)), inversions, translocations, and mobile-element transpositions. These variants have proven to be extensive and associated with phenotypic differences in natural populations along the tree of life. Thus, determining the extent of these variants is essential to uncovering the genetic basis of natural variation and potential adaptive evolutionary processes. The occurrence of fungicide resistance in fungal plant pathogens results in great losses of quality and yield in crops and makes the management strategies challenging. Thus, understanding the genetic basis of resistance is a crucial step in the improvement of disease management strategies. It is also expected structural variants to affect fungicide resistance responses. In this thesis, the intra- and inter-species extent of SVs, as well as single nucleotide polymorphisms (SNPs), have been determined for two prominent species of the Monilinia genus (the causal agents of brown rot disease in pome and stone fruits): M. fructicola and M. laxa for the first time and their relation to the DMI group fungicide propiconazole has been investigated. In addition, the sensitivity status of the Monilinia population from Turkey consisting of 108 M. fructicola and 20 M. laxa isolates against Demethylation Inhibitor (DMI) group fungicide propiconazole has presented that the population is sensitive against DMI-propiconazole. Then, whole-genome sequences of a total of 16 isolates that were selected based on their fungicide sensitivity phenotypes are investigated. The potential role of SVs (INDELs, CNVs, inversions, and mobile elements (TEs)) is then investigated for eight M. fructicola and eight M. laxa isolates in DMI-propiconazole resistance-related candidate genes that are previously proven to be involved in DMI resistance. Genome-wide SVs and single-nucleotide polymorphisms (SNPs) have been identified for the first time comprehensively by intra- and inter-species genome comparisons for these species. As a result, the genomes of M. fructicola were found to be more variant rich in contrast to M. laxa based on the reference-based variant calling (with a total number of 266.618 and 190.599 SNPs; 1540 and 918 SVs, respectively). The total number of characterized duplications was extremely low for both species with seven duplications for M. fructicola and three duplications for M. laxa genomic datasets. The extent, as well as distribution of SVs, presented high conservation within the species and high diversity between the species. Moreover, the detailed characterization of CNV for each isolate revealed that around 0.67% of M. fructicola genomes and 2.06% of M. laxa genomes are CN variable. In addition, the transposable element content was found at approximately 9% for both species with more than 15 classified families. The Class I/Retrotransposons (especially the LTR elements) were found to be the most dominant TEs for both species as expected. Kimura-2 distances of TEs in reference genomes of both species have shown that the recent insertions were low for both species and most of the current TE content was due to older insertions/proliferations. Finally, the investigation of the potential role of SVs in DMI-propiconazole resistance revealed that no SV in the form of insertion, deletion, duplication, and inversion differ at or near candidate CYP51 and ABC transporter genes for isolates with differentiating sensitivity levels for both species. However, the presence/absence of a nested TE consisting of Class II/Sat-2-LVa and Class I/DNA-8-3_HM at the upstream region of the CYP51 gene in M. fructicola isolates presented a potential risk for resistance against DMI-propiconazole.